TP Antibiogramme
Méthode de diffusion en gélose (méthode des disques)
SÉCURITÉ OBLIGATOIRE - Travail en conditions stériles
- • EPI complets : blouse fermée, gants nitrile, lunettes de protection
- • Zone de travail stérile : bec Bunsen allumé ou PSM (Poste de Sécurité Microbiologique)
- • Manipulation de souches pathogènes : travail aseptique STRICT
- • Élimination DASRI : tout matériel contaminé dans conteneurs jaunes
- • Décontamination : eau de Javel 2,6% chlore actif, 15 min de contact
Objectifs pédagogiques
Savoirs (connaissances)
- • Comprendre le principe de la méthode de diffusion en gélose
- • Définir la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice)
- • Connaître les catégories cliniques : S (Sensible), I (Intermédiaire), R (Résistant)
- • Comprendre le lien entre diamètre d'inhibition et CMI
- • Appréhender les mécanismes de l'antibiorésistance
Savoir-faire (compétences)
- • Réaliser un ensemencement en nappe (écouvillonnage)
- • Déposer des disques d'antibiotiques de manière normalisée
- • Mesurer les diamètres d'inhibition avec précision
- • Interpréter les résultats selon les abaques CA-SFM/EUCAST
- • Rédiger un antibiogramme clinique
Principe de la méthode
L'antibiogramme par diffusion en gélose (méthode de Kirby-Bauer) permet de déterminer la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques. Un disque imprégné d'antibiotique est déposé sur une gélose ensemencée : l'antibiotique diffuse dans la gélose en créant un gradient de concentration décroissant.
Relation diamètre - CMI :
Consignes de sécurité détaillées
Équipements de Protection
- Blouse : manches longues, fermée, en coton
- Gants : nitrile non poudrés, taille adaptée
- Lunettes : protection latérale obligatoire
- Cheveux : attachés ou charlotte
Travail en conditions stériles
- Zone de stérilité : rayon 15-20 cm autour du bec
- Flamber les anses et cols de tubes
- Ouvrir les boîtes de Petri en biais (angle 45°)
- Travailler rapidement et méthodiquement
Élimination des déchets
- DASRI : boîtes de Petri, gants, écouvillons
- Collecteur OPCT : objets piquants/coupants
- Décontamination : Javel 2,6%, 15 min
- Paillasse : Surfanios ou alcool 70°
Protocole de décontamination à la Javel :
- Préparer de l'eau de Javel à 2,6% de chlore actif (diluer si nécessaire)
- Immerger le matériel contaminé ENTIÈREMENT
- Laisser agir minimum 15 minutes
- Rincer abondamment à l'eau claire
- Éliminer les résidus en filière DASRI si usage unique
Matériel nécessaire
Matériel microbiologique
- Boîtes de Petri (90 mm) avec gélose Mueller-Hinton (MH) - épaisseur 4 mm ± 0,5 mm
- Souche bactérienne à tester (ex : Escherichia coli, Staphylococcus aureus)
- Suspension bactérienne standardisée (0,5 McFarland ≈ 1-2 × 10⁸ UFC/mL)
- Écouvillons stériles (coton ou Dacron)
- Eau physiologique stérile (NaCl 0,9%)
- Étalon de turbidité McFarland 0,5
Petit matériel de laboratoire
- Distributeur de disques ou pince stérile
- Règle ou pied à coulisse (précision au mm)
- Bec Bunsen + allumette/briquet
- Tubes à essai stériles
- Anse de platine ou anse à usage unique
- Marqueur indélébile
- Étuve réglée à 35-37°C
Disques d'antibiotiques (sélection pour TP STL) :
| Antibiotique | Code | Charge (μg) | Famille |
|---|---|---|---|
| Amoxicilline | AMX | 25 | β-lactamines (Pénicillines) |
| Amoxicilline + Ac. clavulanique | AMC | 20/10 | β-lactamines + Inhibiteur |
| Céfotaxime | CTX | 30 | Céphalosporines 3G |
| Gentamicine | GEN | 10 | Aminosides |
| Ciprofloxacine | CIP | 5 | Fluoroquinolones |
| Triméthoprime-Sulfaméthoxazole | SXT | 1,25/23,75 | Sulfamides + Triméthoprime |
| Érythromycine | ERY | 15 | Macrolides |
| Tétracycline | TET | 30 | Tétracyclines |
Conservation des disques : +2 à +8°C à l'abri de la lumière. Sortir 30 min avant utilisation pour équilibration thermique.
Protocole détaillé - Step by Step
Préparation de la suspension bactérienne
~15 min- 1.1Prélever 3-5 colonies isolées de la culture pure (18-24h) à l'aide d'une anse stérile
- 1.2Émulsionner dans un tube contenant 5 mL d'eau physiologique stérile
- 1.3Homogénéiser au vortex (ou par agitation manuelle)
- 1.4Ajuster la turbidité à 0,5 McFarland en comparant à l'étalon (fond rayé noir et blanc)
Ensemencement de la gélose (technique en nappe)
~10 min- 2.1Identifier la boîte de Petri (nom, date, souche) sur le fond avec un marqueur
- 2.2Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne
- 2.3Essorer l'excès contre la paroi interne du tube (éviter les flaques)
- 2.4Écouvillonner toute la surface de la gélose en 3 passages :
Technique des 3 passages (rotation 60°) :
Passage 1 (horizontal)
Passage 2 (+60°)
Passage 3 (+60°)
Tourner la boîte de 60° entre chaque passage pour couvrir toute la surface uniformément.
Finir par un passage sur les bords.
Dépôt des disques d'antibiotiques
~10 min- 3.1Sortir les disques du réfrigérateur 30 min avant (équilibration thermique)
- 3.2À l'aide d'un distributeur ou d'une pince stérile, déposer les disques
- 3.3Règles de positionnement :
- Maximum 6 disques par boîte de 90 mm
- Distance entre disques : minimum 24 mm de centre à centre
- Distance du bord : minimum 15 mm
- Appuyer légèrement sur chaque disque pour assurer le contact
- Ne JAMAIS déplacer un disque déjà posé (diffusion instantanée !)
Disposition recommandée (6 disques) :
Les disques forment un hexagone régulier autour du centre
Incubation
16-20h- 4.1Ne pas dépasser 15 minutes entre le dépôt des disques et l'incubation
- 4.2Placer les boîtes couvercle vers le bas (retournées) dans l'étuve
- 4.3Incuber à 35-37°C pendant 16 à 20 heures
- 4.4Atmosphère : aérobie standard (pas de CO₂ sauf indication)
Paramètres d'incubation
Température : 35-37°C | Durée : 16-20h | Position : retournée
Lecture et mesure des diamètres d'inhibition
~20 min- 5.1Vérifier la culture confluente (tapis bactérien uniforme)
- 5.2Observer les zones d'inhibition (zones claires autour des disques)
- 5.3Mesurer le diamètre de chaque zone en mm :
- Utiliser une règle graduée ou un pied à coulisse
- Mesurer le diamètre complet (bord à bord de la zone claire)
- Lecture à l'œil nu sur fond sombre (S. aureus) ou en transparence (Gram-)
- Ignorer les petites colonies isolées dans la zone (possible contamination)
- Noter le diamètre du disque lui-même si aucune zone : 6 mm = Résistant
Schéma de lecture :
Zone d'inhibition
(mesurer le diamètre total)
Pas de zone
(diamètre = 6 mm = R)
Interprétation des résultats
~15 minComparer les diamètres mesurés aux valeurs critiques CA-SFM/EUCAST pour déterminer la catégorisation clinique :
Tableau d'interprétation CA-SFM/EUCAST 2024
Diamètres critiques (mm) pour les principales espèces bactériennes. Ces valeurs sont issues des recommandations CA-SFM/EUCAST.
Entérobactéries (E. coli, Klebsiella, Enterobacter...)
| Antibiotique | Charge | S ≥ (mm) | R < (mm) |
|---|---|---|---|
| Amoxicilline (AMX) | 25 μg | 19 | 19 |
| Amox/Ac. clavulanique (AMC) | 20/10 μg | 19 | 19 |
| Céfotaxime (CTX) | 30 μg | 20 | 17 |
| Gentamicine (GEN) | 10 μg | 17 | 14 |
| Ciprofloxacine (CIP) | 5 μg | 25 | 22 |
| Triméth/Sulfaméthox (SXT) | 1,25/23,75 μg | 14 | 11 |
Staphylococcus aureus
| Antibiotique | Charge | S ≥ (mm) | R < (mm) |
|---|---|---|---|
| Pénicilline G | 1 U | 26 | 26 |
| Céfoxitine (FOX) - détection SARM | 30 μg | 22 | 22 |
| Érythromycine (ERY) | 15 μg | 21 | 18 |
| Gentamicine (GEN) | 10 μg | 18 | 18 |
| Tétracycline (TET) | 30 μg | 22 | 19 |
Source : Recommandations CA-SFM/EUCAST 2024. Valeurs simplifiées pour usage pédagogique. Consulter les tables officielles pour un usage clinique.
Résultats attendus et interprétation
Exemple 1 : Antibiogramme d'Escherichia coli sauvage
Résultats typiques d'une souche sensible à la plupart des antibiotiques :
| Antibiotique | Ø mesuré (mm) | Interprétation |
|---|---|---|
| Amoxicilline | 24 | S |
| Céfotaxime | 30 | S |
| Gentamicine | 22 | S |
| Ciprofloxacine | 32 | S |
Exemple 2 : E. coli producteur de BLSE (Bêta-Lactamase à Spectre Étendu)
Souche multi-résistante - Alerte épidémiologique !
| Antibiotique | Ø mesuré (mm) | Interprétation |
|---|---|---|
| Amoxicilline | 6 | R |
| Amox/Ac. clavulanique | 15 | R |
| Céfotaxime | 12 | R |
| Gentamicine | 20 | S |
| Ciprofloxacine | 18 | R |
Image synoptique : Résistance à l'amoxicilline, partiellement restaurée par l'acide clavulanique (synergie visible = "bouchon de champagne"). Résistance aux C3G → suspicion de BLSE.
Phénotypes remarquables à reconnaître
Synergie AMC/C3G ("bouchon de champagne")
Zone d'inhibition élargie entre AMC et CTX → Suspicion de production de BLSE
Antagonisme ERY/CLI (test D)
Zone aplatie entre érythromycine et clindamycine → Résistance inductible MLSb
Hétéro-résistance
Petites colonies dans la zone d'inhibition → Population bactérienne hétérogène
Swarming (Proteus)
Voile de croissance envahissant la boîte → Caractéristique de Proteus mirabilis
Erreurs fréquentes et solutions
Symptômes : Zones d'inhibition anormalement petites (inoculum trop dense) ou trop grandes (inoculum trop faible)
Solution : Ajuster PRÉCISÉMENT à 0,5 McFarland en comparant à l'étalon sur fond rayé. Utiliser un spectrophotomètre si disponible (DO 625nm = 0,08-0,13).
Symptômes : Zones d'inhibition déformées, ovales, ou avec "queue de comète"
Solution : Ne JAMAIS déplacer un disque une fois posé. La diffusion commence instantanément au contact de la gélose. Recommencer avec une nouvelle boîte si nécessaire.
Symptômes : Colonies de morphologies différentes, pas de tapis uniforme
Solution : Partir d'une culture PURE (1 seule morphologie coloniale). Effectuer un isolement préalable si doute. Travailler en zone stérile.
Symptômes : Résultats non reproductibles, diamètres aberrants
Solution : L'épaisseur de gélose DOIT être de 4 mm ± 0,5 mm. Trop fine = zones trop grandes. Trop épaisse = zones trop petites. Couler environ 20-25 mL de gélose par boîte de 90 mm.
Symptômes : Zones d'inhibition plus petites qu'attendu pour une souche sensible de contrôle
Solution : Vérifier la date de péremption. Conserver à +2-8°C dans un dessiccateur. Laisser les disques atteindre la température ambiante avant utilisation (30 min).
Symptômes : Lecture trop précoce (culture non confluente) ou trop tardive (zones floues)
Solution : Respecter 16-20h d'incubation. Lire dès que la culture est confluente. Au-delà de 24h, les résultats peuvent être faussés.
L'antibiorésistance : un enjeu majeur de santé publique
L'antibiogramme est un outil clé dans la lutte contre l'antibiorésistance. Selon l'OMS, la résistance aux antimicrobiens (RAM) est l'une des 10 principales menaces pour la santé publique mondiale.
Chiffres clés (2024)
- • 1,27 million de décès/an attribuables directement à la RAM
- • 4,95 millions de décès associés à la RAM
- • 10 millions de décès/an prévus en 2050 si rien ne change
- • En France : 5 500 décès/an liés à la RAM
Bactéries prioritaires (OMS)
- • Priorité critique : Entérobactéries BLSE et carbapénémases, Acinetobacter, Pseudomonas
- • Priorité élevée : SARM, Enterococcus vancomycine-R, Helicobacter, Salmonella, Neisseria gonorrhoeae
Mécanismes de résistance à connaître
1. Inactivation enzymatique
β-lactamases (pénicillinases, BLSE, carbapénémases) qui hydrolysent l'antibiotique
2. Modification de la cible
Modification des PLP (SARM), des ribosomes (macrolides), de l'ADN gyrase (quinolones)
3. Diminution de la perméabilité
Perte de porines chez les Gram négatifs → diminution de l'entrée de l'antibiotique
4. Efflux actif
Pompes d'efflux qui expulsent l'antibiotique hors de la cellule (multi-résistance)
Rôle du technicien de laboratoire
En tant que futur technicien STL BBB, vous serez en première ligne pour :
- • Détecter les phénotypes de résistance (BLSE, SARM, carbapénémases)
- • Alerter le clinicien pour une antibiothérapie adaptée
- • Participer à la surveillance épidémiologique (signalement BHRe)
- • Contribuer au bon usage des antibiotiques (stewardship)
Pour aller plus loin
Ressources officielles
- • CA-SFM/EUCAST : Recommandations françaises annuelles
- • EUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
- • Santé Publique France : Surveillance de la RAM
- • OMS : Rapports mondiaux sur l'antibiorésistance
Notions connexes BAC STL
- • CMI et CMB (E-test, microdilution)
- • Courbe de bactéricidie
- • Pharmacocinétique/Pharmacodynamique (PK/PD)
- • Transfert horizontal de gènes (conjugaison, transduction)
