TP PCR - Amplification de l'ADN
Objectifs pédagogiques
Savoirs (Connaissances)
- Comprendre le principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Connaître les 3 étapes d'un cycle PCR : dénaturation, hybridation, élongation
- Identifier les composants du mix PCR et leur rôle
- Calculer le nombre de copies théoriques après n cycles (2ⁿ)
Savoir-faire (Compétences)
- Préparer un mix PCR en conditions stériles (PSM ou hotte)
- Programmer un thermocycleur avec les paramètres adaptés
- Analyser les résultats par électrophorèse sur gel d'agarose
- Interpréter un gel et estimer la taille des amplicons
Sécurité au laboratoire
EPI obligatoires
Lunettes
Gants nitrile
Blouse
Pictogrammes GHS des réactifs
Irritant
(BET, TAE)
Mutagène
(BET)
Précautions spécifiques PCR
- Travailler sous PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) ou hotte à flux laminaire
- Séparer les zones pré-PCR et post-PCR pour éviter les contaminations
- Utiliser des cônes à filtre (filter tips) pour éviter les aérosols
- Le BET (Bromure d'Ethidium) est mutagène : gants obligatoires, déchets spécifiques
- Ne jamais ouvrir le thermocycleur en cours de cycle
- Changer de gants entre la préparation du mix et le dépôt ADN
Principe de la PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une technique d'amplification enzymatique in vitro permettant de produire des millions de copies d'un fragment d'ADN spécifique à partir d'une quantité infime de matrice.
1. Dénaturation
94-98°C pendant 15-30s
Séparation des 2 brins d'ADN par rupture des liaisons hydrogène
2. Hybridation
50-65°C pendant 15-60s
Les amorces (primers) s'hybrident aux séquences complémentaires
3. Élongation
72°C pendant 30s-2min
La Taq polymérase synthétise le brin complémentaire (5'→3')
Amplification exponentielle : Après n cycles, on obtient théoriquement 2n copies.
Exemple : 30 cycles → 2³⁰ ≈ 1 milliard de copies !
Matériel et réactifs
Équipements
| Équipement | Qté |
|---|---|
| Thermocycleur (PCR machine) | 1 |
| Micropipettes P2, P20, P200, P1000 | 1 jeu |
| Cônes à filtre stériles | 20+ |
| Tubes PCR 0.2 mL (thin-wall) | 8 |
| Portoir réfrigéré (glace pilée) | 1 |
| Microcentrifugeuse (spin-down) | 1 |
| Vortex | 1 |
| PSM ou hotte à flux laminaire | 1 |
| Cuve électrophorèse + générateur | 1 |
| Transilluminateur UV | 1 |
Réactifs
| Réactif | Volume/tube |
|---|---|
| Tampon PCR 10X (avec MgCl₂) | 5 µL |
| dNTPs mix (10 mM chaque) | 1 µL |
| Amorce Forward (10 µM) | 1 µL |
| Amorce Reverse (10 µM) | 1 µL |
| Taq polymérase (5 U/µL) | 0.25 µL |
| ADN matrice (10-100 ng/µL) | 1 µL |
| Eau ultra-pure stérile | 40.75 µL |
| Volume total | 50 µL |
Pour l'électrophorèse : Gel d'agarose 1.5%, tampon TAE 1X, BET ou SYBR Safe, marqueur de taille (100 bp ladder), tampon de charge 6X
Protocole step-by-step
APhase préparatoire (20 min)
Préparation du poste de travail
- • Nettoyer le PSM avec éthanol 70%
- • Allumer la lampe UV pendant 15 min
- • Disposer tout le matériel stérile sous le PSM
- • Préparer un portoir avec glace pilée
Décongélation des réactifs
- • Sortir les réactifs du congélateur -20°C
- • Laisser décongeler sur glace (5-10 min)
- • Exception : La Taq polymérase reste toujours sur glace !
- • Vortexer brièvement les dNTPs et amorces
- • Spin-down rapide pour ramener les liquides au fond
Identification des tubes
- • Numéroter les tubes PCR 0.2 mL sur le capuchon
- • Tube 1-6 : Échantillons ADN (E1 à E6)
- • Tube 7 : Témoin positif (T+)
- • Tube 8 : Témoin négatif (T- : eau au lieu d'ADN)
- • Placer tous les tubes sur le portoir glacé
BPréparation du Master Mix (15 min)
Calcul du Master Mix
Pour 8 réactions + 10% de marge (9 volumes) :
| Réactif | × 1 | × 9 |
|---|---|---|
| Tampon PCR 10X | 5 µL | 45 µL |
| dNTPs (10 mM) | 1 µL | 9 µL |
| Amorce F (10 µM) | 1 µL | 9 µL |
| Amorce R (10 µM) | 1 µL | 9 µL |
| Taq pol. (5 U/µL) | 0.25 µL | 2.25 µL |
| H₂O ultra-pure | 40.75 µL | 366.75 µL |
| Total (sans ADN) | 49 µL | 441 µL |
Préparation du Master Mix
- • Dans un tube 1.5 mL stérile, ajouter dans cet ordre :
- 1. Eau ultra-pure (366.75 µL)
- 2. Tampon PCR 10X (45 µL)
- 3. dNTPs mix (9 µL)
- 4. Amorce Forward (9 µL)
- 5. Amorce Reverse (9 µL)
- 6. Taq polymérase (2.25 µL) - EN DERNIER !
- • Mélanger délicatement par pipetage (5-6 fois)
- • Spin-down rapide
⚠️ Important : La Taq polymérase est fragile ! Ne jamais vortexer, ajouter en dernier, garder sur glace.
Distribution du Master Mix
- • Distribuer 49 µL de Master Mix dans chaque tube PCR
- • Changer de cône entre chaque tube
- • Garder les tubes sur glace
CAjout de l'ADN matrice (10 min)
Ajout des matrices ADN
- • CHANGER DE GANTS avant cette étape !
- • Ajouter 1 µL d'ADN échantillon dans tubes E1-E6
- • Ajouter 1 µL d'ADN contrôle dans tube T+
- • Ajouter 1 µL d'eau dans tube T- (témoin négatif)
- • Volume final : 50 µL par tube
Homogénéisation finale
- • Fermer hermétiquement tous les tubes
- • Vortexer brièvement chaque tube (2-3 sec)
- • Spin-down pour ramener le liquide au fond
- • Vérifier l'absence de bulles d'air
DProgrammation et lancement du thermocycleur (1h30)
Programmation du thermocycleur
| Étape | Temp. | Durée | Cycles |
|---|---|---|---|
| Dénaturation initiale | 95°C | 5 min | 1× |
| Dénaturation | 95°C | 30 sec | 30× |
| Hybridation (annealing) | 58°C | 30 sec | |
| Élongation | 72°C | 45 sec | |
| Élongation finale | 72°C | 7 min | 1× |
| Conservation | 4°C | ∞ | - |
Temps total estimé : ~1h25 (5 + 30×1.75 + 7 min)
Lancement de la PCR
- • Placer les tubes dans le bloc thermique
- • Vérifier que les tubes sont bien enfoncés (contact thermique)
- • Fermer le couvercle chauffant (105°C)
- • Sélectionner le programme et lancer
- • Noter l'heure de début
EÉlectrophorèse et analyse (45 min)
Préparation du gel d'agarose
- • Préparer gel agarose 1.5% dans tampon TAE 1X
- • Chauffer au micro-ondes jusqu'à dissolution complète
- • Refroidir à ~55°C, ajouter BET (0.5 µg/mL) ou SYBR Safe
- • Couler le gel, insérer le peigne (10 puits)
- • Laisser polymériser 30 min
Dépôt des échantillons
- • Retirer le peigne délicatement
- • Immerger le gel dans TAE 1X (2-3 mm au-dessus)
- • Mélanger 8 µL produit PCR + 2 µL tampon de charge 6X
- • Déposer dans l'ordre : Marqueur | E1-E6 | T+ | T-
- • Charger 5 µL de marqueur 100 bp dans le puits 1
Migration électrophorétique
- • Brancher les électrodes (cathode côté puits)
- • Appliquer 100V pendant 30-45 min
- • Vérifier la migration (bleu de bromophénol)
- • Stopper quand le front atteint les 2/3 du gel
Révélation et photographie
- • Placer le gel sur le transilluminateur UV
- • Porter les lunettes de protection UV obligatoires !
- • Observer les bandes fluorescentes
- • Photographier le gel avec le système d'imagerie
- • Annoter : date, échantillons, paramètres
Résultats attendus
Gel d'électrophorèse attendu
Interprétation des résultats
Résultat positif
- • Bande unique à la taille attendue (~450 pb pour cet exemple)
- • Intensité similaire au témoin positif
- • Pas de bandes parasites
Résultat négatif
- • Absence de bande dans l'échantillon
- • Le témoin négatif doit TOUJOURS être vide
- • Si T- présente une bande = contamination !
Calcul de la taille
Utiliser le marqueur de taille (100 bp ladder) pour estimer la taille de l'amplicon par interpolation sur une courbe semi-logarithmique : log(taille) = f(distance de migration)
Erreurs fréquentes et dépannage
| Problème observé | Causes possibles | Solutions |
|---|---|---|
| Pas de bande du tout |
|
|
| Bandes multiples (smear) |
|
|
| Bande dans le témoin négatif |
|
|
| Bande de mauvaise taille |
|
|
| Bande faible/diffuse |
|
|
Questions d'exploitation (Bac STL)
Q1. Rôle des composants du mix PCR
Expliquez le rôle de chaque composant du mélange réactionnel :
- Tampon PCR : Maintient le pH optimal (8.3-8.8) et apporte les cofacteurs (MgCl₂)
- MgCl₂ : Cofacteur essentiel de la Taq polymérase, stabilise les hybrides ADN-amorces
- dNTPs : Briques élémentaires (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) pour la synthèse du brin néoformé
- Amorces (primers) : Séquences oligonucléotidiques qui délimitent la région à amplifier et servent d'amorçage pour la Taq
- Taq polymérase : ADN polymérase thermorésistante (de Thermus aquaticus) qui synthétise le brin complémentaire à 72°C
Q2. Calcul d'amplification
À partir d'une molécule d'ADN unique, calculez le nombre de copies obtenues après 25 cycles de PCR.
Formule : N = N₀ × 2ⁿ
Application : N = 1 × 2²⁵ = 33 554 432 copies
Conclusion : Après 25 cycles, on obtient théoriquement plus de 33 millions de copies !
Q3. Importance du témoin négatif
Pourquoi est-il indispensable d'inclure un témoin négatif dans chaque série de PCR ?
Le témoin négatif (eau au lieu d'ADN) permet de détecter une éventuelle contamination des réactifs ou du matériel par de l'ADN exogène. Si une bande apparaît dans le T-, cela signifie que les résultats positifs ne sont pas fiables et que l'expérience doit être recommencée avec du matériel neuf.
Q4. Spécificité des amorces
Quels critères doit respecter une paire d'amorces pour assurer une PCR spécifique ?
- • Longueur de 18-25 nucléotides
- • Température de fusion (Tm) similaire pour les 2 amorces (±2°C)
- • Teneur en GC entre 40-60%
- • Pas de structure secondaire (hairpin, dimères)
- • Extrémité 3' terminée par G ou C
- • Aucune complémentarité entre les 2 amorces
- • Séquence unique dans le génome cible (vérification BLAST)
Q5. Analyse du gel d'électrophorèse
Sur un gel d'agarose 1.5%, pourquoi les fragments d'ADN migrent-ils vers l'anode et comment estimer leur taille ?
L'ADN est chargé négativement (groupements phosphate) et migre donc vers l'anode (+). Les petits fragments migrent plus vite car ils traversent plus facilement les mailles du gel d'agarose. On estime la taille en comparant la distance de migration avec celle du marqueur de taille de référence et en traçant une courbe étalon semi-logarithmique.
Q6. PCR quantitative (qPCR)
En quoi la qPCR diffère-t-elle de la PCR conventionnelle ? Quels sont ses avantages ?
La qPCR (ou PCR en temps réel) utilise des sondes fluorescentes pour mesurer l'amplification en temps réel à chaque cycle. Avantages :
- • Quantification précise du nombre de copies initial
- • Pas besoin d'électrophorèse post-PCR
- • Résultats plus rapides
- • Large gamme dynamique (10⁷ copies)
- • Applications : diagnostic viral, expression génique
Astuces pour réussir votre TP
Organisation du temps
- • Préparez le gel pendant la PCR (gain de 30 min)
- • Calculez le Master Mix AVANT le TP
- • Pré-étiquetez tous vos tubes
Éviter les contaminations
- • Toujours pipeter le témoin négatif EN PREMIER
- • Fermer chaque tube immédiatement après ajout
- • Ne jamais parler au-dessus des tubes ouverts
Précision du pipetage
- • Utiliser la P20 pour les volumes < 10 µL
- • Vérifier l'absence de bulles dans le cône
- • Pipeter contre la paroi du tube (pas dans le liquide)
Conservation des réactifs
- • Aliquoter les dNTPs (évite les cycles gel-dégel)
- • Taq polymérase : -20°C, jamais > 30 min hors glace
- • Amorces : -20°C, centrifuger avant ouverture
Critères d'évaluation (Bac STL)
| Compétence évaluée | Points | Indicateurs de réussite |
|---|---|---|
| S'approprier | 4 | Compréhension du principe, identification du matériel |
| Analyser | 4 | Calculs corrects (dilutions, Master Mix) |
| Réaliser | 8 | Gestes techniques, respect du protocole, organisation, sécurité |
| Valider | 4 | Interprétation du gel, critique des résultats |
| Total | 20 |
