Chromatographie HPLC
High Performance Liquid Chromatography : la technique reine pour la séparation et l'analyse des composés en solution.
Objectifs du Chapitre
I. Principe de la Chromatographie
La chromatographie est une technique de séparation basée sur la différence d'affinité des composés entre deux phases : une phase stationnaire (fixe) et une phase mobile (qui se déplace).
Principe de partage
Chaque composé se répartit entre les deux phases selon son coefficient de partage K :
Plus K est grand, plus le composé a d'affinité pour la phase stationnaire, plus il est retenu et plus son temps de rétention est long.
Types d'interactions
Adsorption
Interactions avec la surface de la phase stationnaire (silice, alumine). Base de la chromatographie en phase normale.
Partage
Distribution du soluté entre deux phases liquides non miscibles. Base de la chromatographie en phase inverse.
Exclusion stérique
Séparation selon la taille des molécules. Les grosses molécules sortent en premier (SEC/GPC).
Échange d'ions
Interactions électrostatiques entre ions du soluté et groupes chargés de la phase stationnaire.
II. Appareillage HPLC
Schéma de la chaîne HPLC
Composants détaillés
🧪 Réservoir d'éluant
- • Solvants de haute pureté (grade HPLC)
- • Dégazage obligatoire (ultrasons, hélium, membrane)
- • Filtration sur membrane 0,45 µm
⚙️ Pompe haute pression
- • Pression de travail : 100-400 bar (jusqu'à 1000 bar en UHPLC)
- • Débit constant : 0,1 à 10 mL/min
- • Types : piston simple, double piston, gradient
- • Pompe quaternaire pour mélanges complexes
💉 Injecteur
- • Vanne d'injection à 6 voies (Rheodyne)
- • Volume d'injection : 1-100 µL (typiquement 20 µL)
- • Passeur automatique d'échantillons possible
🔬 Colonne (cœur du système)
- • Dimensions : 150-250 mm × 4,6 mm (standard)
- • Remplissage : particules de 3-5 µm (1,7 µm en UHPLC)
- • Phase stationnaire greffée sur silice
- • Thermostatée à 25-40°C pour reproductibilité
- • Pré-colonne de protection (garde column)
📊 Détecteur
Le plus courant, composés chromophores
Spectre UV complet en temps réel
Très sensible, composés fluorescents
Universel mais peu sensible
III. Phase Normale vs Phase Inverse
| Caractéristique | Phase Normale (NP) | Phase Inverse (RP) |
|---|---|---|
| Phase stationnaire | Polaire (silice, alumine) | Apolaire (C18, C8, phényl) |
| Phase mobile | Apolaire (hexane, dichlorométhane) | Polaire (eau, méthanol, acétonitrile) |
| Ordre d'élution | Apolaires en premier | Polaires en premier |
| Composés analysés | Lipides, vitamines liposolubles | Médicaments, peptides, métabolites |
| Usage | ~10% des analyses | ~90% des analyses |
Focus : Phase inverse C18
La phase C18 (octadécylsilane) est la plus utilisée. Des chaînes de 18 carbones sont greffées sur la silice, créant une surface hydrophobe.
Si-OH + Cl-Si(CH₃)₂-C₁₈H₃₇ → Si-O-Si(CH₃)₂-C₁₈H₃₇
Plus le composé est hydrophobe, plus il interagit avec les chaînes C18 et plus il est retenu.
- • Eau/Méthanol : économique, bon pour composés moyennement polaires
- • Eau/Acétonitrile : meilleure résolution, pics plus fins, plus cher
- • Ajout d'acide (0,1% TFA ou acide formique) : améliore les pics des composés ionisables
- • Tampon phosphate : contrôle du pH (attention à la précipitation avec organiques)
IV. Paramètres Chromatographiques
4.1 Temps de rétention
Temps mort (t₀)
Temps de passage d'un composé non retenu. Correspond au volume mort de la colonne.
Temps de rétention (tR)
Temps entre l'injection et le maximum du pic. Caractéristique du composé dans les conditions données.
4.2 Facteur de rétention (k)
k représente le rapport du temps passé dans la phase stationnaire au temps passé dans la phase mobile.
Valeur optimale : 2 < k < 10. Si k < 1, le composé sort trop vite. Si k > 20, l'analyse est trop longue.
4.3 Sélectivité (α)
La sélectivité mesure la capacité de la colonne à séparer deux composés. α > 1 signifie que le composé 2 est plus retenu que le composé 1.
4.4 Efficacité (N)
Le nombre de plateaux théoriques N caractérise l'efficacité de la colonne (capacité à donner des pics fins).
w = largeur à la base
w₁/₂ = largeur à mi-hauteur
Une colonne HPLC classique a N = 10 000-20 000. Plus N est grand, meilleure est la séparation.
4.5 Résolution (Rs)
Pics confondus
Pics tangents
Séparation totale
V. Optimisation de la Séparation
Équation de Van Deemter
H = Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique (HEPT), u = vitesse linéaire de la phase mobile
Dépend du remplissage. Minimisé avec des particules uniformes.
Important à faible débit. Négligeable en HPLC.
Dominant en HPLC. Minimisé avec petites particules.
Paramètres d'optimisation
🔄 Composition de la phase mobile
Augmenter la proportion d'organique diminue k (élution plus rapide). Changer le solvant (MeOH → ACN) modifie α.
🌡️ Température
Augmenter T diminue la viscosité, améliore l'efficacité et réduit k. Typiquement 25-40°C.
💧 Débit
Débit optimal autour de 1 mL/min pour colonne standard. Trop rapide = perte d'efficacité. Trop lent = diffusion.
📏 Longueur de colonne
N proportionnel à L. Doubler L double N mais aussi le temps d'analyse et la pression.
⚪ Taille des particules
Petites particules (sub-2µm) = haute efficacité mais haute pression. Base de l'UHPLC.
- • Isocratique : composition constante, simple, pour mélanges similaires
- • Gradient : composition variable, pour mélanges complexes (ex: 20%→80% ACN en 20 min)
- Le gradient améliore la séparation des composés de polarités très différentes
VI. Analyse Quantitative
6.1 Étalonnage externe
- Préparer une gamme de solutions étalons de concentrations connues
- Injecter chaque étalon et mesurer l'aire (ou hauteur) du pic
- Tracer la droite d'étalonnage : Aire = f(concentration)
- Vérifier la linéarité (R² > 0,99)
- Injecter l'échantillon inconnu
- Reporter l'aire sur la droite pour obtenir la concentration
6.2 Étalonnage interne
On ajoute un étalon interne (composé pur, absent de l'échantillon) en quantité connue à chaque solution.
Avantage : compense les variations de volume injecté et les dérives du détecteur.
6.3 Validation de méthode
Linéarité
R² > 0,99, résidus aléatoires
Répétabilité
CV < 2% sur 6 injections
LOD / LOQ
Limite de détection (S/N=3) et quantification (S/N=10)
Exactitude
Taux de recouvrement 98-102%
VII. Pièges à Éviter
❌ Bulles dans le système
Provoquent des fluctuations de pression et de signal. Solution : dégazer les solvants, purger les lignes.
❌ Colonne bouchée
Pression anormalement élevée, pics déformés. Solution : filtrer échantillons (0,45 µm), utiliser pré-colonne.
❌ Traînées de pics (tailing)
Interactions secondaires avec silanols libres. Solution : ajouter modificateur (TEA), utiliser colonne endcapped.
❌ Dérives de la ligne de base
Solvants impurs, équilibration insuffisante. Solution : solvants HPLC grade, équilibrer 20-30 min.
❌ Temps de rétention qui dérivent
Phase stationnaire dégradée, température instable. Solution : thermostaiser, changer colonne si nécessaire.
