TP Culture Bactérienne
Isolement, Dénombrement et Caractérisation
Consignes de Sécurité OBLIGATOIRES
Équipements de Protection Individuelle (EPI)
- • Blouse fermée, manches longues
- • Gants nitrile (changés régulièrement)
- • Lunettes de protection
- • Cheveux attachés
Règles d'hygiène
- • Lavage des mains avant/après manipulation
- • Ne JAMAIS manger, boire, pipeter à la bouche
- • Désinfecter la paillasse (alcool 70°)
- • Élimination DASRI obligatoire
Objectifs du TP
Techniques de Culture
- ✓ Maîtriser l'asepsie
- ✓ Préparer les milieux de culture
- ✓ Ensemencer en conditions stériles
Isolement
- ✓ Technique des stries d'épuisement
- ✓ Étalement en surface
- ✓ Obtention de colonies isolées
Dénombrement
- ✓ Dilutions en série
- ✓ Calcul UFC/mL
- ✓ Interprétation statistique
Rappels Théoriques
Croissance bactérienne
Les bactéries se multiplient par scissiparité (division binaire). Temps de génération : 20 min (E. coli) à plusieurs heures selon l'espèce et les conditions.
Équation de croissance :
N = N₀ × 2ⁿ
où n = nombre de générations
Principe de l'isolement
L'isolement permet d'obtenir des colonies pures issues chacune d'une seule cellule bactérienne. Chaque colonie visible contient environ 10⁶ à 10⁸ bactéries génétiquement identiques (clone).
Matériel Nécessaire
Milieux de Culture
- Bouillon LB (Luria-Bertani)
Milieu riche liquide - 10g/L tryptone, 5g/L extrait levure, 10g/L NaCl
- Gélose Nutritive (GN)
Milieu solide non sélectif - 15g/L agar + nutriments
- Eau physiologique stérile
NaCl 0,9% - pour dilutions
Petit Matériel Stérile
- • Pipettes graduées stériles (1mL, 10mL)
- • Pipettes Pasteur stériles
- • Cônes stériles avec filtre
- • Étaleurs en verre (râteaux)
- • Anses de platine / öses jetables
- • Tubes à essai stériles (10)
- • Boîtes de Petri (∅ 90mm)
- • Portoirs
Équipements
- 🔥Bec Bunsen / Bec électrique
Zone stérile par convection
- 🧊Étuve réglée à 37°C
Incubation 24-48h
- 🔬PSM (optionnel)
Poste de Sécurité Microbiologique
- • Vortex
- • Micropipettes P100, P1000
- • Marqueur indélébile
Souche Bactérienne Utilisée
Escherichia coli K12 - souche de laboratoire non pathogène (classe de risque 1). Culture de 18-24h en phase stationnaire, DO₆₀₀ ≈ 1,0.
Techniques d'Asepsie
Travail au Bec Bunsen
Zone stérile = 15-20 cm autour de la flamme (courant d'air ascendant)
Flamber l'anse/öse jusqu'au rouge vif, laisser refroidir 5s
Flamber les ouvertures de tubes/flacons avant et après chaque prélèvement
Ouvrir les boîtes de Petri à 45°, jamais complètement
Poste de Sécurité Microbiologique (PSM)
Avantages :
- Protection du manipulateur (flux laminaire descendant)
- Protection de l'échantillon (air HEPA filtré)
- Surface de travail plus grande
Précautions :
- Allumer 15 min avant utilisation
- Nettoyer à l'éthanol 70% avant/après
- Ne pas obstruer les grilles de ventilation
Schéma : Zone Stérile au Bec Bunsen
↑ Courant ascendant ↑
╱ ╲
╱ ╲
╱ ╲
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│ ╱ ZONE ╲ │
│ ╱ STÉRILE ╲ │
│ ←15cm→║ 🔥🔥🔥 ║←15cm→ │
│ ║ FLAMME ║ │
│ ╲ ╱ │
│ ╲ ╱ │
└─────────────────────────────────────┘
PAILLASSE
⚠️ Travailler DANS cette zone uniquementIsolement par la Méthode des Stries
Objectif : Obtenir des colonies isolées à partir d'une suspension bactérienne en diluant progressivement l'inoculum sur la gélose.
Préparation du poste de travail
- • Nettoyer la paillasse à l'éthanol 70%
- • Allumer le bec Bunsen (flamme bleue)
- • Disposer le matériel à portée de main dans la zone stérile
- • Identifier la boîte (nom, date, dilution) sur le FOND (pas le couvercle !)
Prélèvement de l'inoculum
- • Flamber l'anse de platine jusqu'au rouge vif
- • Laisser refroidir 5 secondes (ne pas souffler !)
- • Flamber l'ouverture du tube de culture
- • Prélever une petite quantité de suspension (öse pleine)
- • Reflamber l'ouverture et reboucher
Technique des stries d'épuisement (4 quadrants)
Zone 1 : Stries serrées avec l'inoculum initial
→ FLAMBER l'anse
Zone 2 : Partir du bord de zone 1, stries espacées
→ FLAMBER l'anse
Zone 3 : Partir du bord de zone 2, encore plus espacées
→ FLAMBER l'anse
Zone 4 : Quelques stries finales → colonies isolées
⚠️ Point critique : TOUJOURS flamber l'anse entre chaque zone ! C'est ce qui permet la dilution progressive.
Incubation
- • Refermer la boîte
- • Placer couvercle vers le bas (évite condensation sur colonies)
- • Incuber à 37°C pendant 24h
- • Ne pas ouvrir pendant l'incubation
Dilutions en Série et Dénombrement
Objectif : Déterminer la concentration bactérienne (UFC/mL) de la suspension par la méthode des dilutions en cascade et dénombrement sur boîte.
Principe des Dilutions Décimales
SUSPENSION Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5
MÈRE (10⁻¹) (10⁻²) (10⁻³) (10⁻⁴) (10⁻⁵)
│ │ │ │ │ │
│ 1 mL │ 1 mL │ 1 mL │ 1 mL │ 1 mL │
▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼
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│███│──────▶│░░░│──────▶│░ │──────▶│ │──────▶│ │──────▶│ │
│███│ 1mL │░░░│ 1mL │░ │ 1mL │ │ 1mL │ │ 1mL │ │
│███│ │░░░│ │░ │ │ │ │ │ │ │
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~10⁹/mL 9mL EP 9mL EP 9mL EP 9mL EP 9mL EP
│ │ │ │ │
▼ ▼ ▼ ▼ ▼
Étaler Étaler Étaler Étaler Étaler
100µL 100µL 100µL 100µL 100µL
│ │ │ │ │
▼ ▼ ▼ ▼ ▼
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tapis >300 30-300 30-300 <30
INTCPT INTCPT COMPTABLE COMPTABLE imprecisEP = Eau Physiologique stérile (NaCl 0,9%)
Préparation des tubes de dilution
- • Préparer 5 tubes stériles contenant 9 mL d'eau physiologique
- • Identifier chaque tube : 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵
- • Préparer 6 boîtes de Petri identifiées (SM, 10⁻¹ à 10⁻⁵)
Réalisation des dilutions
Pour CHAQUE dilution :
- Vortexer le tube précédent (homogénéisation)
- Prélever 1 mL avec pipette stérile
- Transférer dans le tube suivant (9 mL EP)
- Vortexer immédiatement
- Changer de pipette pour chaque dilution !
Étalement en surface
- • Déposer 100 µL (ou 0,1 mL) de chaque dilution au centre de la boîte
- • Étaler avec un râteau stérile (étaleur en verre ou plastique)
- • Technique : mouvements circulaires + rotation de la boîte
- • Laisser sécher 5 min couvercle entrouvert près de la flamme
Technique d'étalement :
1. Dépôt central 2. Étalement 3. Séchage
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│ │ │ ↺ │ │░░░░░│
│ ● │ ──▶ │↺ ● ↺│ ──▶ │░░░░░│
│ │ │ ↺ │ │░░░░░│
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100 µL Râteau stérile Film homogène
mouvements (5 min séchage)
circulairesIncubation et lecture
- • Incuber à 37°C, 24h, couvercle vers le bas
- • Compter les colonies sur les boîtes contenant 30 à 300 colonies
- • Utiliser un compteur de colonies si disponible
Formule de Calcul UFC/mL
N = n × d / V
N = Concentration en UFC/mL
n = Nombre de colonies comptées
d = Facteur de dilution (ex: 10⁴ pour dilution 10⁻⁴)
V = Volume étalé en mL (0,1 mL = 100 µL)
Exemple de calcul :
Dilution 10⁻⁴ : 145 colonies comptées
Volume étalé : 0,1 mL
N = (145 × 10⁴) / 0,1
N = 1,45 × 10⁷ UFC/mL
Tableau de Lecture Type
| Dilution | 10⁻¹ | 10⁻² | 10⁻³ | 10⁻⁴ | 10⁻⁵ |
|---|---|---|---|---|---|
| Nbre colonies | Tapis | >300 | 185 | 22 | 3 |
| Exploitable ? | ❌ | ❌ | ✅ | ⚠️ limite | ❌ |
✅ Exploitable (30-300 colonies) | ⚠️ Limite basse (<30) | ❌ Non exploitable
Caractérisation des Colonies
Objectif : Décrire les caractéristiques morphologiques des colonies et réaliser une coloration de Gram pour identifier le type bactérien.
Critères Morphologiques (Œil nu)
Schéma des Formes de Colonies
VUE DE DESSUS : VUE DE PROFIL : ⬤ Ronde ═══ Plate ☁ Irrégulière ⌓ Convexe/Bombée ✳ Rhizoïde ⌢ Ombiliquée 〰 Filamenteuse ∪ Cratériforme BORDS : ────── Entiers (lisses) ∿∿∿∿∿∿ Ondulés ▓▓▓▓▓▓ Dentelés ╬╬╬╬╬╬ Lobés
Coloration de Gram (Résumé)
Gram + (Violet)
- • Paroi épaisse (peptidoglycane)
- • Retient le cristal violet
- • Ex: Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus
Gram - (Rose)
- • Paroi fine + membrane externe
- • Perd le violet, prend la safranine
- • Ex: E. coli, Pseudomonas, Salmonella
Fiche de Caractérisation Type
| Critère | Colonie A | Colonie B |
|---|---|---|
| Taille | 2-3 mm | 1 mm |
| Forme | Ronde | Irrégulière |
| Élévation | Convexe | Plate |
| Bords | Entiers | Dentelés |
| Surface | Lisse, brillante | Rugueuse, mate |
| Couleur | Crème | Blanche |
| Gram | Gram - (bacilles) | Gram + (coques) |
Résultats Attendus
Isolement réussi si :
- ✓ Colonies bien séparées en zone 3-4
- ✓ Pas de contamination visible
- ✓ Aspect homogène des colonies (culture pure)
- ✓ Taille et morphologie conformes à E. coli
Dénombrement valide si :
- ✓ Au moins une boîte avec 30-300 colonies
- ✓ Dilutions cohérentes (facteur ~10 entre boîtes)
- ✓ Calcul UFC/mL reproductible
- ✓ Résultat : 10⁸ - 10⁹ UFC/mL pour culture 24h
Pour E. coli K12 (attendu) :
- • Colonies rondes, 2-3 mm, lisses, brillantes, bombées
- • Couleur crème à légèrement grisâtre
- • Bords entiers (réguliers)
- • Gram négatif : bacilles roses au microscope
- • Concentration typique : 1-5 × 10⁸ UFC/mL (culture 18-24h)
Erreurs Fréquentes à Éviter
Technique d'isolement
- Ne pas flamber l'anse entre zones → pas de dilution, tapis bactérien
- Stries qui se chevauchent → colonies non isolées
- Anse trop chaude → tue les bactéries, aucune croissance
- Creuser la gélose → bactéries en profondeur, colonies déformées
Dilutions et dénombrement
- Même pipette pour toutes dilutions → erreur de concentration
- Pas de vortex → suspension non homogène, comptage faussé
- Oublier le facteur volume → erreur de calcul ×10
- Compter une boîte confluente → résultat non fiable
Asepsie
- Travailler hors zone stérile → contamination aéroportée
- Ouvrir boîte à plat → sédimentation de contaminants
- Parler au-dessus des boîtes → projection de salive
Incubation
- Couvercle vers le haut → condensation tombe sur colonies
- Température incorrecte → croissance lente ou nulle
- Incubation trop longue → colonies confluentes, satellites
Élimination des Déchets (DASRI)
Déchets biologiques
- • Boîtes de Petri ensemencées → sac jaune DASRI
- • Tubes de culture → autoclavage puis DASRI
- • Milieux de culture usagés → autoclavage obligatoire
- • Gants, pipettes jetables → poubelle DASRI
Procédure
- Ne JAMAIS jeter de matériel biologique à la poubelle normale
- Autoclavage : 121°C, 20 min, 1 bar
- Après autoclavage : poubelle DASRI ou ordures selon protocole local
- Anse de platine : flamber puis ranger (réutilisable)
Questions de Réflexion
1. Pourquoi doit-on flamber l'anse entre chaque zone de stries ?
Piste : Pensez au principe de dilution progressive...
2. Pourquoi ne compte-t-on que les boîtes contenant 30-300 colonies ?
Piste : Fiabilité statistique et erreur de comptage...
3. Si vous obtenez des colonies de morphologies différentes sur une boîte inoculée avec une culture pure, que suspectez-vous ?
Piste : Contamination, variants phénotypiques, erreur de manipulation...
4. Pourquoi incube-t-on les boîtes couvercle vers le bas ?
Piste : Condensation et intégrité des colonies...
5. Calculez : 87 colonies en dilution 10⁻⁵, volume étalé 100 µL. Quelle est la concentration ?
Réponse : N = (87 × 10⁵) / 0,1 = 8,7 × 10⁷ UFC/mL
Points Clés à Retenir
- L'asepsie est la base de toute manipulation microbiologique
- Flamber l'anse = TOUJOURS entre chaque étape
- 1 colonie = 1 clone = ~10⁶-10⁸ cellules identiques
- Dilution 10⁻¹ = 1 mL dans 9 mL = facteur 10
- 30-300 colonies = zone de comptage fiable
- UFC/mL = (colonies × dilution) / volume étalé (mL)
- Gram + = violet / Gram - = rose
- Tout déchet biologique → DASRI, jamais poubelle normale
TP conforme au programme de Terminale STL spécialité Biotechnologies (BBB)
Dernière mise à jour : Mars 2026
