Chromatographie HPLC
Duree : 50 min · Difficulte : ⭐⭐⭐⭐
Objectifs du cours
- •Comprendre le principe de la chromatographie (phase mobile, phase stationnaire)
- •Decrire les composants d un systeme HPLC (pompe, injecteur, colonne, detecteur)
- •Distinguer les differents types de chromatographie (phase normale, phase inverse, echange d ions)
- •Analyser un chromatogramme : temps de retention, resolution, aire des pics
- •Realiser une analyse qualitative et quantitative (etalonnage externe)
- •Connaitre les applications industrielles : pharmaceutique, environnement, agroalimentaire
I. Introduction a la chromatographie
La chromatographie est une technique de separation des constituants d un melange. Son nom vient du grec khroma (couleur) et graphein (ecrire), car les premiers travaux concernaient la separation de pigments colores.
Le principe repose sur la distribution differentielle des composes entre deux phases :
Phase mobile
Fluide (liquide ou gaz) qui entraine les composes a travers le systeme. En HPLC, c est un liquide (solvant ou melange de solvants).
Phase stationnaire
Materiau fixe qui retient les composes de maniere selective. En HPLC, c est un solide finement divise (silice greffee).
Les composes sont separes car ils interagissent differemment avec la phase stationnaire. Plus un compose a d affinite avec la phase stationnaire, plus il est retarde.
Analogie simple
Imagine une course de kayak sur une riviere avec des obstacles (roseaux). Les kayaks legers et lisses passent vite, ceux qui accrochent les obstacles sont ralentis. A l arrivee, ils sont separes selon leur vitesse !
II. Qu est-ce que l HPLC ?
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
Chromatographie Liquide Haute Performance
L HPLC est une technique de chromatographie en phase liquide qui utilise :
- •Une haute pression (jusqu a 400 bar) pour forcer le passage de la phase mobile
- •Des colonnes remplies de particules tres fines (1,7 a 5 μm)
- •Des detecteurs sensibles pour detecter les composes elues
Cette technique permet d analyser des molecules non volatiles,thermolabiles (sensibles a la chaleur) ou de haute masse molaire, ce que la chromatographie en phase gazeuse (GC) ne peut pas faire.
| Critere | HPLC | GC (phase gazeuse) |
|---|---|---|
| Phase mobile | Liquide | Gaz (He, N₂, H₂) |
| Temperature | Ambiante a 60°C | 50 a 350°C |
| Echantillons analyses | Non volatils, thermolabiles | Volatils, stables |
| Masse molaire max | Illimitee (proteines, polymeres) | < 500 g/mol |
III. Composants d un systeme HPLC
Un systeme HPLC est compose de plusieurs elements essentiels :
Schema d un systeme HPLC
Reservoirs
Solvants A/B
Pompe
Haute pression
Injecteur
5-100 μL
Colonne
Separation
Detecteur
UV, DAD, MS
Acquisition
Logiciel
1. Reservoirs de solvants
Contiennent la phase mobile : eau, acetonitrile (ACN), methanol, tampons...
- • Solvants de qualite HPLC grade (tres purs)
- • Degazage pour eliminer les bulles d air dissoutes
- • Possibilite de melanger plusieurs solvants (gradient)
2. Pompe haute pression
Delivre un debit constant de phase mobile malgre la resistance de la colonne.
Caracteristiques : Pression jusqu a 400 bar (UHPLC: 1200 bar), debit 0,1 a 2 mL/min, precision < 1%
- • Mode isocratique : composition constante de la phase mobile
- • Mode gradient : composition variable au cours de l analyse
3. Injecteur (ou passeur automatique)
Introduit l echantillon dans le flux de phase mobile de maniere reproductible.
- • Volume d injection : 1 a 100 μL (typiquement 10-20 μL)
- • Vanne d injection a 6 voies
- • Passeur automatique pour les series d analyses
4. Colonne chromatographique
C est le coeur du systeme : elle contient la phase stationnaire qui separe les composes.
Dimensions typiques : 50 a 250 mm (longueur) × 2,1 a 4,6 mm (diametre interne)
- • Remplissage : silice greffee (C18, C8, phenyl, amino...)
- • Taille des particules : 1,7 a 5 μm (plus petit = meilleure resolution)
- • Pre-colonne de protection pour allonger la duree de vie
5. Detecteur
Mesure une propriete physico-chimique des composes elues pour les identifier et les quantifier.
| Type de detecteur | Principe | Applications |
|---|---|---|
| UV-Visible | Absorption a une longueur d onde | Molecules avec chromophores |
| DAD (barrette de diodes) | Spectre UV-Vis complet | Identification + purete |
| Fluorescence | Emission apres excitation | Tres sensible, specifique |
| RI (indice de refraction) | Variation de l indice | Sucres, polymeres |
| MS (spectrometrie de masse) | Rapport masse/charge | Identification structurale |
6. Systeme d acquisition et traitement
Logiciel qui pilote l appareil, enregistre le signal du detecteur et traite les donnees (integration des pics, rapports).
- • Exemples : Chromeleon, Empower, OpenLab, MassHunter
- • Calcul automatique des aires, temps de retention, concentrations
IV. Types de chromatographie HPLC
Selon la nature de la phase stationnaire et les interactions mises en jeu, on distingue plusieurs modes :
1. Chromatographie en phase normale (NP-HPLC)
Phase stationnaire : Polaire (silice non greffee, alumine, diol)
Phase mobile : Apolaire (hexane, heptane + modificateur)
Ordre d elution : Apolaires sortent en premier
Applications : Isomeres, lipides, vitamines liposolubles
2. Chromatographie en phase inverse (RP-HPLC) - La plus utilisee !
Phase stationnaire : Apolaire (silice greffee C18, C8)
Phase mobile : Polaire (eau + acetonitrile ou methanol)
Ordre d elution : Polaires sortent en premier
Applications : Medicaments, peptides, metabolites, >80% des analyses
C18 = octadecyl : Chaine de 18 carbones greffee sur la silice. C est la phase la plus universelle en HPLC.
3. Chromatographie d echange d ions (IEX)
Phase stationnaire : Groupes ioniques (SO₃⁻, NH₄⁺)
Separation : Selon la charge des molecules
Elution : Gradient de force ionique ou pH
Applications : Proteines, acides amines, ions mineraux
4. Chromatographie d exclusion sterique (SEC/GPC)
Phase stationnaire : Gel poreux (polystyrene, silice poreuse)
Separation : Selon la taille (volume hydrodynamique)
Ordre d elution : Grosses molecules en premier
Applications : Polymeres, proteines, masse molaire moyenne
V. Le chromatogramme : lecture et parametres
Le chromatogramme est la representation graphique du signal du detecteur en fonction du temps. Chaque compose apparait sous forme d un pic.
Chromatogramme type avec 3 composes
Parametres cles
| Parametre | Symbole | Definition | Unite |
|---|---|---|---|
| Temps mort | t₀ | Temps pour traverser la colonne sans retention | min |
| Temps de retention | tᵣ | Temps entre l injection et le sommet du pic | min |
| Temps de retention reduit | t'ᵣ = tᵣ - t₀ | Temps passe dans la phase stationnaire | min |
| Facteur de retention | k = t'ᵣ / t₀ | Mesure de la retention (ideal : 2 < k < 10) | sans |
| Largeur a mi-hauteur | w₁/₂ | Largeur du pic a 50% de sa hauteur | min |
| Nombre de plateaux | N = 5,54 × (tᵣ/w₁/₂)² | Efficacite de la colonne (> 10 000) | sans |
| Resolution | Rs = 2(tᵣ₂ - tᵣ₁)/(w₁ + w₂) | Separation entre 2 pics (Rs > 1,5 = baseline) | sans |
Point cle pour l examen
Le temps de retention est caracteristique d un compose dans des conditions donnees. Il permet l identification par comparaison avec un etalon. L aire du pic est proportionnelle a la quantite de compose.
VI. Analyse qualitative et quantitative
1. Analyse qualitative : identifier un compose
L identification repose sur la comparaison du temps de retention avec celui d un etalon pur analyse dans les memes conditions.
Methode :
- Analyser un etalon pur du compose suppose
- Noter son temps de retention tᵣ (etalon)
- Analyser l echantillon inconnu
- Comparer : si tᵣ (inconnu) ≈ tᵣ (etalon) → identification probable
Pour une identification certaine, utiliser un detecteur MS ou faire un co-injection (spike).
2. Analyse quantitative : doser un compose
La quantification utilise la proportionnalite entre l aire du pic et la concentration. La méthode la plus courante est l etalonnage externe.
Methode de l etalonnage externe :
- Preparer une gamme de solutions etalons de concentrations connues (C₁, C₂, C₃, C₄, C₅)
- Analyser chaque etalon en HPLC
- Mesurer l aire des pics correspondants (A₁, A₂, A₃, A₄, A₅)
- Tracer la droite d etalonnage : A = f(C)
- Analyser l echantillon inconnu et mesurer son aire Ax
- Reporter Ax sur la droite pour determiner Cx
Droite d etalonnage (regression lineaire)
A = a × C + b
Equation de la droite
R² > 0,999 (lineaire)
Autres méthodes de quantification : etalonnage interne (avec un etalon interne ajoute), ajouts doses, normalisation des aires.
Formule de calcul de la concentration inconnue
Cx = (Ax - b) / a
ou a = pente, b = ordonnee a l origine, Ax = aire du pic inconnu
VII. Applications de l HPLC
L HPLC est utilisee dans de nombreux secteurs industriels et de recherche :
Industrie pharmaceutique
- • Controle qualite des medicaments (purete, dosage)
- • Analyse de stabilite (degradation)
- • Recherche de nouveaux principes actifs
- • Pharmacocinetique (metabolites)
- • Controle des impuretes (< 0,1%)
Environnement
- • Analyse des polluants dans l eau (pesticides, HAP)
- • Surveillance de la qualite de l air
- • Dosage des micropolluants (ng/L)
- • Controle des rejets industriels
- • Analyse des sols contamines
🍎 Agroalimentaire
- • Dosage des vitamines (A, D, E, K, C, B)
- • Analyse des sucres, acides organiques
- • Detection des residus de pesticides
- • Controle des additifs (colorants, conservateurs)
- • Analyse des mycotoxines (aflatoxines)
💄 Cosmetiques
- • Dosage des filtres UV
- • Analyse des conservateurs (parabenes)
- • Controle des parfums et aromes
- • Detection des allergenes
🧬 Biologie / Biochimie
- • Analyse des proteines et peptides
- • Purification de biomolecules
- • Dosage des acides amines
- • Analyse des nucleotides
🏥 Analyses cliniques
- • Dosage de medicaments dans le sang (TDM)
- • Detection de drogues et toxiques
- • Analyse des catecholamines
- • Diagnostic de maladies metaboliques
VIII. Optimisation d une separation HPLC
Pour obtenir une bonne separation, plusieurs parametres peuvent etre ajustes :
| Parametre | Effet sur la retention | Conseil d optimisation |
|---|---|---|
| % de solvant organique | ↑ % organique → ↓ retention (phase inverse) | Ajuster pour k entre 2 et 10 |
| pH de la phase mobile | Influence l ionisation des composes | pH = pKa ± 2 pour modifier la selectivite |
| Temperature de colonne | ↑ T → ↓ viscosite → meilleure efficacite | 30-60°C, thermostatee |
| Debit de phase mobile | ↑ debit → ↓ temps d analyse | 0,5-1,5 mL/min (colonne 4,6 mm) |
| Type de colonne | Change la selectivite | C18, C8, phenyl, HILIC selon les composes |
| Mode gradient | Ameliore la separation de melanges complexes | Gradient lineaire ou par paliers |
Strategie generale
1. Commencer avec une colonne C18 et un gradient eau/acetonitrile. 2. Ajuster le % d organique pour avoir des k raisonnables. 3. Si la selectivite est mauvaise, modifier le pH ou changer de phase stationnaire. 4. Optimiser le gradient pour separer les pics mal resolus.
📊 Chiffres cles a retenir
400 bar
Pression max HPLC
C18
Phase la plus utilisee
Rs > 1,5
Resolution optimale
UV 254 nm
Detection classique
📝 Resume
- HPLC = Chromatographie Liquide Haute Performance (separation + quantification)
- Principe : distribution entre phase mobile (liquide) et phase stationnaire (colonne)
- Composants : reservoirs → pompe → injecteur → colonne → detecteur → acquisition
- Phase inverse (C18) : phase stationnaire apolaire, phase mobile polaire (80% des analyses)
- Chromatogramme : signal vs temps, chaque pic = un compose
- Temps de retention (tᵣ) : identification du compose
- Aire du pic : quantification via etalonnage (A = f(C))
- Applications : pharma, environnement, agroalimentaire, cosmetiques, clinique
🎯 Teste tes connaissances
1. En chromatographie en phase inverse, les composes polaires sortent :
→ En premier (ils ont moins d affinite avec la phase stationnaire apolaire)
2. Quelle grandeur permet d identifier un compose ?
→ Le temps de retention (tᵣ)
3. Quelle grandeur permet de quantifier un compose ?
→ L aire du pic (proportionnelle a la concentration)
4. Une resolution Rs = 1,5 signifie :
→ Separation complete (retour a la ligne de base entre les pics)
